Разработка и использование метода серотипирования для определения циркулирующих генотипов вируса гепатита С

С.Л.МУКОМОЛОВ *, А.А.КОЛОБОВ**, И.А.СОЗИНА *, М.ЛАППАЛАЙНЕН***, Е.А.КАМПЕ-НЕММ**, Н.В.ЖЕЛЕЗНОВА*, И.И.МАЛКОВА *, В.А.ШПЕНЬ **
аборатория вирусных гепатитов Санкт-Петербургского Института имени Пастера *, Лаборатория химии пептидов НИИ ОЧБ **, Кафедра вирусологии Университета Хельсинки, Финляндия ***

Вирус гепатита С (ГС) относится к возбудителям с чрезвычайно выраженной гетерогенностью популяции. Установлено, что пациенты с хроническим ГС, ассоциированным с различными генотипами вируса, по разному отвечают на интерферонотерапию.Определение генотипов вируса ГС важно при проведении эпидемиологических исследований, так как позволяет хорошо документировать передачу возбудителя.

Цель настоящего исследования — оценить возможности метода серотипирования для определения генотипов вируса ГС. Для серотипирования был адоптирован оригинальный метод, описанный группой исследователей из Великобритании под руководством P.Simmonds (1993,1995). 12 коротких пептидов (18-19 аминокислотных остатков), представляющих эпитопы NS4 белка 6 генотипов вируса ГС, были получены методом твердофазного синтеза, очищенны с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и использованы в качестве основы иммуносорбента для проведения иммуноферментного анализа с сыворотками содержащими антитела к NS4 белку (анти-NS4). Наличие анти-NS4 подтверждалось в ИФА со смесью пептидов для серотипирования или методом иммуноблоттинга ( LiaTek HCV, Organon Teknika; Wellcozyme HCV Western Blot, Murex).

Специфичность определения генотипов вируса ГС разаработанным вариантом серотипирования изучена при сопоставлении результатов “слепого” тестирования панели сывороток из 154 анти-NS4-позитивных образцов с известными генотипами вируса (за исключением 1 образца), определенными с помощью RFLP по методике описанной P.Pohjanpelto et al. (1996) на кафедре вирусологии Хельсинского университета.

Для изучения особенностей распространения вариантов вируса ГС на некоторых территориях России (Санкт-петербург, Нижний Новгород, Уфа, Белгород) и сопредельных стран (Белоруссия, Казахстан, Грузия) методом серотипирования были тестированы анти-NS4-позитивные сыворотки, полученные от 474 человек, включая 157 доноров крови, 237 больных гепатитом С и 80 лиц из групп риска ( внутривенные наркоманы, онкогематологические больные, пациенты центров хронического гемодиализа, туберкулезных стационаров и др.).

Результаты “слепого” тестирования 154 сывороток с известными генотипами вируса гепатита С по RFLP представлены в таблице №1 . В целом серотипировано 148 образцов (96,1%). Полное совпадение серо- и генотипов наблюдалось в 130 сыворотках из 148 (87,8%). Для отдельных генотипов этот показатель оказался различным. Наибольшая частота совпадения результатов отмечена для HCV-1 — (92,5%) с разбросом показателя от 87,1% для сывороток субтипа 1в до 100% для сывороток со смешанными субтипами 1а+1в; для HCV-3 — 94,3% (все сыворотки относились к субтипу 3а). Наименьший процент совпадения результатов наблюдался при тестировании сывороток, относящихся по RFLP к генотипу HCV-2 (80%). При серотипировании было обнаружено 5 сывороток, которые можно было отнести к генотипу HCV-4. Однако при сравнении результатов с данными RFLP совпадение отмечено только в 2-х пробах (40%).

Высокая корреляция результатов определения генотипов вируса ГС, полученных двумя совершенно разными методами, позволила использовать серотипирование для изучения циркуляции вариантов вируса ГС на отдельных территориях. Результаты этой части исследований суммированы в таблице №2. В целом на всех изученных территориях выявлена циркуляция 3 генотипов вируса ГС, в единичных случаях в четырех регионах определен генотип HCV-4. Наиболее часто определялся генотип HCV-1 (от 47,1% в сыворотках из Грузии до 74,4% — из Белоруссии). Второе ранговое место по частоте выявления занимал практически на всех территориях генотип HCV-3 (от 15,5% в сыворотках из Белоруссии до 34,0% — из Нижнего Новгорода). Значительно реже изученные сыворотки содержали типоспецифические анти-NS4 HCV-2. Максимальная частота выявления этого генотипа была установлена в сыворотках из Белоруссии (12,7%), Казахстана (13,7%), а минимальная — в сыворотках из Санкт-Петербурга (3,8%). В 35 сыворотках, представляющих все изучаемые регионы, при серотипировании было установлено наличие анти-NS4 разных генотипов (смешанные генотипы). Наибольшую долю среди сывороток со смешанными генотипами составили образцы в которых одновременно определялись HCV-1 и HCV-3 (26 из 35 — 74,3%), т.е наиболее часто встречающиеся генотипы. Остальные варианты сочетаний встречались значительно реже — HCV-1+HCV-2 (8,6%), HCV-2+HCV-3 (11,4%). Сочетание HCV-1 + HCV-4 выявлено в двух сыворотках из Грузии (5,7%).

Материалы настоящего исследования свидетельствуют о том, что использование синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам неструктурного белка NS4, в качестве основного компонента иммуносорбента для ИФА позволяет успешно определять генотипы вируса ГС в сыворотках инфицированных этим возбудителем людей и проводить мониторинг за циркуляцией геновариантов возбудителя в регионах.

Для определения генотипов вируса ГС также использован метод ПЦР-RFLP с типоспецифическими рестрикционными ферментами Bst U1 и Bst N1 и последующим анализом продуктов рестрикции с помощью горизонтального электрофореза в 3% геле агарозы (Thiers V. et al., 1997). Этим методом протестированы сыворотки крови 15 больных хроническим ГС, получавших интерферонотерапию. РНК вируса ГС выявлена в 14 образцах, при этом в 6 случаях (42,9%) установлен субгенотип 3а, в 3 (21,4%) — гентип 1 ( 2- субгенотип 1в: 1 — субгенотип 1а). РНК вируса ГС, выделенная из 4 образцов относилась к редко выявляемым генотипам возбудителя — 4/5. Последние находки требуют дальнейшего тщательного изучения.

Таблица 1. СОПОСТAВЛЕНИЕ PЕЗУЛЬТAТОВ ОПPЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОТИПОВ ВИPУСA ГЕПAТИТA С МЕТОДAМИ RFLP И СЕPОТИПИPОВAНИЯ

ПPИМЕЧAНИЕ: * — не типиpовaлось **- aбс.число/ пpоцент

Таблица 2. ЧAСТОТA ВЫЯВЛЕНИЯ PAЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ ВИPУСA ГЕПAТИТA С МЕТОДОМ СЕPОТИПИPОВAНИЯ НA ОТДЕЛЬНЫХ ТЕPPИТОPИЯХ PОССИИ И СОПPЕДЕЛЬНЫХ СТPAНAХ

ПPИМЕЧAНИЕ: * — aбс.число сывоpоток с дaнным генотипом/ % (нa 100 сывоpоток с укaзaнной теppитоpии)
Литература:
1.Pohjanpelto P.,Lappalainen M.,Widell A. et al.// Clin.Diagn.Virol. -1996. -Vol.7. -P. 7-16
2.Simmonds P.,Holmes E.C.,Cha T.A. et al.// J.Gen.Virol.-1993 .-Vol.74.-P. 2391 -2399