Диагностика ЦМВИ (цитомегаловирусной инфекции)

1. Методы диагностики

Для определения активности ЦМВИ используются вирусологические и молекулярные методы диагностики, а также выявление с помощью моноклональных антител антигенов ЦМВ, экспрессированных в клетках крови во время репликации. Для обнаружения маркеров специфического анти-ЦМВ иммунного ответа в последние годы наиболее часто исползуют иммуноферментный анализ (ИФА).

Вирусологическое исследование с определением цитопатического эффекта является “золотым стандартом диагностики” вирусных инфекции (В.И. Покровский, O.K. Позднеев, 1998). Однако из-за трудоемкости и длительности исследования, а также вследствие появления в настоящее время новых прогрессивных методик классическое вирусологическое исследование в практическом здравоохранении используется все реже.’

Выявления генома ЦМВ при помощи ДНК-гибридизации и по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) — является в настоящее время наиболее признанным методом диагностики. Следует отметить, что для опре­деления клинически значимой репликации ЦМВ важно происхождение взятого для обследования образца (М.С. Долгих, 1997). Считается, что в качестве материала для исследования должна использоваться кровь, т.к. именно обнаружение в крови самого возбудителя (вирусемия), или его антигенов (антигенемия), или его генома (ДНК-емия) достоверно указывают на клинически значимую активность репликации ЦМВ (М.Р. Landini, 1993; D.O. White, 1994; G. Germa, 1995 и др.).

Серологическое обследование. Наиболее принятым среди всех серологических тестов, используемых для диагностики ЦМВИ, является иммуноферментный анализ (ИФА). При помощи серологических методов исследования выявляют анти-ЦМВ-АТ IgM и анти-ЦМВ-АТ IgG, являющиеся маркерами специфического иммунного ответа на ЦМВ. Выявление анти-ЦМВ-АТ IgM свидетельствует об активной ЦМВИ, чаще — первич­ной. Обнаружение только анти-ЦМВ-АТ IgG не позволяет охарактеризовать период заболевания. Антитела данного класса, появляясь вслед за IgM в острой фазе инфекционного процесса, продолжают синтезироваться и после выздоровления в течение длительного времени. При ИФА с параллельным определением авидности AT серологическое обследование может существенно дополнить результаты вирусологических и молекулярных методов диагностики ЦМВИ (Н.А. Коровина, А.Л. Заплатников, 1999). Определение авидности анти-ЦМВ-АТ IgG повышает диагностиче­скую ценность метода (Blackburn et al., 1991). Авидность AT в течение иммунного процесса постепенно повышается (Eisen et al., 1964). По степени авидности IgG можно косвенно охарактеризовать период и остроту инфекционного процесса (Eisen et al., 1964; Siskind et al., 1969 и др.): выявление низкоавидных анти-ЦМВ-АТ IgG свидетельствует о текущей или

К модифицированным методам вирусологического исследования относят т.н. быстрый культуральный метод (shell vial assay). При этом после непродолжительного культивирования культуры клеток, в которую был внесен материал от обследуемого, проводится определение ранних антигенов ЦМВ с помощью моноклональных антител (Н.Е.Макарова и соавт., 1996:М.Р. Landini, 1993).

Изучается возможность использования методики выявления непосредственно в клетках периферической крови тех антигенов ЦМВ, которые обнаруживаются только в период репликации вируса. В качестве таких антигенов рассматриваются белок вирусного тегумента — фосфопротеин рр65 (ppUL83) и главный белок сверхранней фазы репликации IE1 (UL123) (А.Р. Berg et al., 1989; Т.Н. The et al., 1993; Т. Meyer et al., 1994).

недавно перенесенной ЦМВИ, а обнаружение высокоавидных антител позволяет исключить активную фазу заболевания (N.К.Blackburn et al., 1991;

B.Lafacga et al., 1997).

2. Принципы лабораторной диагностики ЦМВИ

Лабораторная диагностика должна основываться на применении комплекса методов, включающих не только верификацию этиологического агента (идентификация самого возбудителя, его генома или антигенов) и обнаружение серологических маркеров иммунного ответа (специфические антитела), но и определение остроты инфекционного процесса (изучение активности репликации вируса и раздельное определение анти-ЦМВ-АТ классов IgM и IgG с их авидностью) (табл.3). При этом для получения достоверных результатов и правильной их трактовки должны соблюдаться следующие правила:

• Серологическое обследование должно проводиться до введения препаратов крови (плазма, иммуноглобулины и др.);

• Серологическое обследование новорожденных и детей первых меся­цев жизни должно проводиться с одновременным серологическим обследованием матерей (для уточнения генеза иммуноглобулинов -“материнские” или “собственные”);

• Серологическое обследование должно проводиться методом “парных сывороток” с интервалом 14-21 день, одним и тем же методом в одном и том же диагностическом учреждении;

• Оценка результатов серологических исследований должна проводитья с учетом возможных особенностей характера и фазы иммунного ответа;

Таблица 1

Лабораторные критерии активности ЦМВИ

1. Маркеры активной репликации ЦМВ:

Вирусемия;

Антигенемия (рр 65 (UL83) и др.);

ДНК-емия;

2. Иммунологические маркеры активной ЦМВИ:

Сероконверсия (выявление анти-ЦМВ-IgM и/или низкоавидных анти-ЦМВ-IgG у ранее серонегативных лиц);

4-х кратное и выше нарастание титров анти-ЦМВ-IgG в “парных сыворотках”.

Особо следует подчеркнуть, что сероконверсия (появление специфических AT у ранее серонегативного пациента) появляется позже клинических проявлений инфекции и выявления прямых маркеров репликации вируса (виремии, ДНК-емии или АГ-емии). Целесообразно также отметить, что у некоторых детей с врожденной ЦМВИ из-за развития иммунологической толерантности к АГ вируса цитомегалии возможен неадекватный специфический анти-ЦМВ иммунный ответ (инфицирование ЦМВ не сопровождается эффективным синтезом анти-ЦМВ-АТ).

Первичная ЦМВИ в период беременности возможна только среди женщин, серонегативных к ЦМВ. При этом у беременных с адекватным иммунным ответом, в основном, отмечается бессимптомное течение ин­фекции либо легкий катар верхних дыхательных путей. Значительно реже, как правило, на фоне иммунодефицитных состояний, выявляются клинически манифестные формы ЦМВИ в виде мононуклеозоподобного синдрома и/или гепатита. Следует отметить, что, независимо от клинических вариантов заболевания, при первичной ЦМВИ выявляются прямые (вире-мия, ДНК-емия или АГ-емия) и косвенные (анти-ЦМВ-АТ IgM и/или низ-коавидные анти-ЦМВ-АТ IgG) лабораторные маркеры активной репликации вируса цитомегалии.

Под реактивацией ЦМВИ подразумевают период активной репликации вируса при персистирующем течении заболевания у ранее серопо-зитивных лиц (т.е. у ранее инфицированных). Следует отметить, что общедоступные лабораторные методики не позволяют дифференцировать непосредственно реактивацию латентно-персистирующей ЦМВИ, реинфекцию и суперинфекцию другим штаммом вируса цитомегалии.

Клинически реактивация ЦМВИ чаще протекает бессимптомно, либо проявляется в виде иннапарантных форм, напоминающих легкое течение ОРВИ (субфебрилитет, ринофарингит, кашель, озноб, быстрая утомляе­мость и др.). Значительно реже встречаются мононуклеозоподобный синдром или поражение внутренних органов. Лабораторными критериями реативации ЦМВИ являются обнаружение в крови самого вируса (виремия), или его генома (ДНК-емия), или его антигенов (АГ-емия), наряду с выявлением серологических маркеров (анти-ЦМВ-АТ класса IgM и/или низкоавидных анти-ЦМВ-АТ класса IgG) у ранее серопозитивных женщин.

Следует подчеркнуть, что лабораторное подтверждение реактивации ЦМВИ в период беременности не может основываться только на выявле­нии повышенных титров анти-ЦМВ-АТ класса IgG. Изолированное выявление у беременной высокого уровня анти-ЦМВ-АТ класса IgG, может быть проявлением поликлональной активации анамнестического иммуни­тета у серопозитивной женщины. Поэтому диагностическое значение определения специфических AT в период беременности имеет крайне низкую роль, если оно проводится изолированно, без одновременного уточнения индекса авидности специфических AT и, главное (!), — без выявления прямых маркеров репликации вируса (виремии, ДНК-емии, АГ-емии).

Таким образом, среди беременных женщин целесообразно выделять группу высокого риска по внутриутробной передаче вируса цитомегалии плоду и развитию врожденной ЦМВИ. В эту группу должны быть включены женщины, переносящие в период беременности первичную или вторичную ЦМВИ. При этом самое пристальное внимание следует уделять женщинам, которые ранее были серонегативны и во время беременности перенесли первичную ЦМВ инфекцию. Поскольку клинические проявления ЦМВИ, за исключением редких случаев, минимальные и могут быть расценены как банальное ОРЗ, то важную роль в своевременной диагностике заболевания играет адекватное лабораторное исследование и правильная трактовка полученных результатов (табл. 4).

Таблица 2

Риск инфицирования плода и лабораторные критерии диагностики различных вариантов течения ЦМВИ в период беременности

Форма инфекции в период беременности	Наличие вирусемии	Антигены ЦМВ	Анти-ЦМВ-АТ	Риск инфициро-вання плода
Латентная	Нет	Не обнаружива­ются	IgG	Крайне низкий
Персистирующая	Нет	Обнаруживаются	IgG,	До 2° о
Реактивированная	Есть	Обнаруживаются	Нарастают IgG, возмож­но появление IgM	До 8° о
Первичная инфекция	Есть	Обнаруживаются	IgM, постепенное нарастание низкоавидных IgG в “парных сыворотках”	До 50° о

В случаях невозможности проведения полноценного комплекса лабораторных исследований для подтверждения этиологии заболевания целесообразно в группу риска включать беременных, переносящих мононуклеозоподобное заболевание, а также женщин, имеющих отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (выкидыши, мертворождения, смерть детей от внутриутробных инфекций и т.д.).

Таблица 3

Женщины с высоким риском внутриутробной передачи ЦМВИ:

1. Переносящие первичную ЦМВИ в период беременности.

Обязательные критерии диагностики: Маркеры активной репликации ЦМВ (виремия или АГ-емия, или ДНК-емия) и иммунологические маркеры активности инфекционного процесса (в меньшей степени) — сероконверсия — у ранее серонегативных женщин даже при бессимптомном течении заболевания.

2. Переносящие вторичную ЦМВИ в период беременности.

Обязательные критерии диагностики: Маркеры активной репликации ЦМВ (виремия или АГ-емия, или ДНК-емия) и, в меньшей степени, иммунологические маркеры активности инфекционного процесса (возможное появление анти-ЦМВ-АТ IgM, нарастание концентрации низкоавидных анти-ЦМВ-АТ IgG в “парных сыворотках”) у ранее серопозитивных женщин даже при бессимптомном течении заболева­ния.

3. Переносящие в период беременности мононуклеозоподобные заболе­вания, даже в тех случаях, когда отсутствуют возможности лабораторного обследования на ЦМВИ.

Абсолютным критерием для включения в группу высокого риска по внутриутробному инфицированию плода вирусом цитомегалии является обнаружение у женщины во время беременности маркеров активной репликации ЦМВ (виремия, АГ-емия, ДНК-емия), даже при бессимптомном течении у нее ЦМВИ.

В настоящее время единой тактики по ведению беременных, переносящих ЦМВИ, нет. Лечение беременных с ЦМВИ также не разработано. Следует отметить, что беременность является официальным противопоказанием для применения ганцикловира и фоскарнета — эффективных анти-ЦМВ виростатических препаратов. Для снижения риска инфицирования плода при первичной ЦМВИ в период беременности может быть эффективным введение женщине специфического анти-ЦМВ-иммуноглобулина для внутривенного введения (Цитотект). Обсуждаются вопросы о воз­можности терапии ЦМВИ в период беременности препаратами интерфе-ронов и другими иммуномодуляторами разных групп, однако, с позиций “доказательной медицины” убедительных данных об эффективности и безопасности данных методов лечения до настоящего времени не получено. Изучаются вопросы разработки эффективной ЦМВ-вакцины для иммунизации серонегативных женщин детородного возраста.

3. Критерии диагностики внутриутробной ЦМВИ

Обследованию на ЦМВИ подлежат дети, имеющие симптоматику врожденной инфекции, а также без клинических признаков TORCH-синдрома, если они рождены женщинами из группы риска по внутриутробной передаче ЦМВ.

У новорожденных детей в раннем неонатальном периоде при подозрении на ЦМВИ (клинико-анамнестические данные) следует проводить идентификацию возбудителя любым из доступных методов (вирусологическим, ПЦР или выявление АГ вируса). В последние годы для детекции возбудителя все чаще используется ПЦР. Материалом при этом может служить любая биологическая среда организма (пуповинная кровь, слюна, моча, смывы трахеи, ротоглотки, мазки с конъюнктивы, из уретры и т.д). Однако только в том случае, когда у новорожденных геном ЦМВ обнаруживается в крови и ликворе, это можно трактовать как признак активного периода внутриутробной ЦМВИ. Если ДНК вируса обнаруживается в клетках других биологических сред, то однозначную оценку периоду заболевания дать нельзя. В данном случае необходима оценка характера иммунного ответа на АГ возбудителя.

Для уточнения остроты процесса показано серологическое исследование методом ИФА с количественным определением анти-ЦМВ-АТ классов М и G. Обязательно повторное исследование уровней (титров) специфических антител в динамике через 3—4 нед. (“парные сыворотки”) в сопоставлении с результатами серологического обследования матери.

Выявление AT класса IgM в пуповинной крови, а также в крови ребенка первых недель жизни является одним из важных критериев диагностики внутриутробной ЦМВ-инфекции (Н.М. Чаплыгина, В.Я. Кицак. 1996). Подтверждением активного периода врожденной ЦМВИ служит также выявление, наряду с анти-ЦМВ IgM, низкоавидных анти-ЦМВ-IgG с нарастанием их титров в динамике.

Особо следует отметить, что выявление антицитомегаловирусных иммуноглобулинов G в сыворотке крови новорожденного без сопоставле­ния с материнскими титрами не является диагностически значимым вследствие возможности их трансплацентарного переноса из организма матери. Только при динамическом (с интервалом в 14-21 день) сравнении уровня анти-ЦМВ-IgG новорожденного ребенка с уровнем анти-ЦМВ-IgG в крови матери можно судить об их природе. Если титры анти-ЦМВ-АТ класса IgG при рождении равны материнским, а при повторном исследовании через 3 — 4 недели — снижаются приблизительно в 1,5-2 раза, то определяемые у ребенка IgG являются материнскими.

При исследовании детей в постнеонатальном возрасте показано исследование, направленное на выявление возбудителя (вирусологиче­ским (классический или модифицированный) или молекулярным (ПЦР) методами) и специфических анти-ЦМВ-АТ (ИФА с определением авидности AT). У детей в возрасте до 4-6 месяцев жизни серологическое обследование проводится с обязательным одновременным исследованием матери и последующим сопоставлением титров и авидности специфических AT. При серологическом обследовании ребенка в возрасте старше б месяцев может исследоваться только кровь ребенка с контролем в динамике через 3-4 недели без обязательного сопоставления с напряженностью ма­теринского анти-ЦМВ иммунитета. При этом порой трудно провести дифференциацию между пре- и постнатальным характером инфицирования вирусом цитомегалии. Косвенным признаком может служить характер авидности выявленных анти-ЦМВ-АТ. В тех случаях, когда в этом возрасте выявляются высокоавидные анти-ЦМВ IgG, то с большей степе­нью достоверности можно предполагать внутриутробный характер инфицирования. Если же анти-ЦМВ IgG имеют низкую авидность, то нельзя исключить постнатальное инфицирование, особенно при одновременном обнаружении и анти-ЦМВ IgM.

Независимо от возраста детей обнаружение специфических анти-ЦМВ-АТ класса IgM, а также выявление 4-х кратного прироста титра в “парных сыворотках” анти-ЦМВ-АТ класса IgG, либо обнаружение низкоавидных анти-ЦМВ-АТ класса IgG свидетельствует об активном (остром) периоде инфекции (Blackburn et al., 1991).

В тех случаях, когда у новорожденного ребенка имеются клиниче­ские признаки TORCH-синдрома или анамнестические факторы риска по развитию внутриутробного инфицирования вирусом цитомегалии он должен быть обязательно обследован на ЦМВИ (табл. 6). Целью обследования является верификация возбудителя и уточнение активности заболева­ния. Абсолютными критериями верификации диагноза “врожденная ЦМВИ” является обнаружение в крови самого возбудителя (виремия), или его генома (ДНК-емия), или его антигенов (АГ-емия). Серологические маркеры инфекции (выявление а7нти-ЦМВ-АТ) являются менее надежными, но в тех случаях, когда нет возможности проведения ПЦР или вирусологического обследования, в качестве лабораторных критериев врожденной ЦМВИ могут рассматриваться выявленные у новорожденно­го анти-ЦМВ IgM, а также низкоавидные анти-ЦМВ IgG, при нарастании их концентрации в динамике.

Таблица 4. Показания для обследования новорожденных на ЦМВИ

Клинические:

> Поражение ЦНС (очаговая неврологическая симптоматика, судороги, синдром угнетения, микроцефалия, гидроцефалия, а также нейросонографические находки — кисты, кальцификаты и др.);

> Желтуха, прямая гипербилирубинемия, гепатоспленомегалия, повышение активности аминотрансфераз;

> Геморрагический синдром, тромбоцитопения, анемия с ретикулоцитозом;

> Недоношенность, синдром задержки внутриутробного развития

Анамнестические:

> Перенесенные матерью в период беременности мононуклеозоподобные заболевания;

> Выявление у матери во время беременности сероконверсии к вирусу цитомегалии;

> Выявление у матери во время беременности маркеров активной репликации вируса цитомегалии;

> Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез матери (выкидыши, мертворождения и т.д.)